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WB常用试剂配方

1.WB样本制备相关试剂

WB时,我们第一步就是要获得待测蛋白样本,这里我们一般会用到样本裂解液(Lysis Buffer)

蛋白裂解液包含以下几个组份:缓冲系统、盐离子、离液剂、还原剂和蛋白酶抑制剂。其中蛋白酶抑制剂种类繁多,可根据实验需求挑选合适品类。

类别

试剂

金属蛋白酶抑制剂 

EDTA-2Na、EGTA-2Na等

磷酸酶抑制剂

原钒酸钠、焦磷酸钠、

β-甘油磷酸钠、氟化钠等

丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶抑制剂

PMSF

氨基肽酶抑制剂

bestatin

天冬氨酸蛋白酶抑制剂

pepstatin A

半胱氨酸蛋白酶抑制剂

E64

说明

1.原钒酸钠需要经过激活才能有效发挥抑制作用(调pH值至10左右,然后加热至无色,冷却后再调pH值至10,如此反复至pH值稳定在10即可)。

2.PMSF剧毒,在水溶液中不稳定,所以PMSF都是在有机试剂、异丙醇、DMSO中溶解的。

▲ 蛋白酶抑制剂类型

RIPA裂解液(RIPA buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液,通常用来作为WB提取蛋白首选裂解液。

并且生产测试过程中,我们研发人员也对传统的RIPA裂解液做了一些改进,以下是改进版RIPA裂解液配方

RIPA裂解液(配 1000 mL)

Tris

6 g

NaCl(Sodium Chloride)

8.76 g

脱氧胆酸钠(Sodium Deoxycholate)

5 g

SDS

1 g

NaF(Sodium Fluoride)

0.42 g

EDTA·2Na·2H₂O

1.86 g

Triton X-100

10 mL

盐酸调pH至7.4,补ddH₂O定容至1000mL,4℃保存。

注:PMSF及其它蛋白酶抑制剂现用现加 一般PMSF工作浓度1 mM,其他蛋白酶抑制剂根据产品说明书推荐浓度使用。

除了可以根据目标蛋白的表达部位选择不同的裂解液以获得较好的提取效果以外(如膜蛋白或组蛋白),任何组分提取均可采用这款RIPA裂解液

2.凝胶制备相关试剂

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE,它有两种形式:SDS-PAGE及Native-PAGE。

SDS-PAGE体系中有SDS,适用于变性蛋白,是最常用的一种PAGE,靶标电泳移率仅与分子量相关;Native-PAGE为非变性体系,主要用来分析活性蛋白及复合物,靶标电泳迁移率与分子量及电荷大小均相关。

 

▲ SDS-PAGE电泳示意图

SDS-PAGE中,凝胶对蛋白质的分离取决于凝胶所形成的孔径大小,而凝胶孔径大小与凝胶浓度相关(指分离胶浓度,即每100亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度),故不同分子量的蛋白质选择不同的凝胶浓度,分离效果会更好。

分离胶浓度(%)

线性分离范围(kDa)

10+15(三层胶)

4-40

15

15-45

12.5

15-60

10

20-100

8

30-200

▲ 不同分离胶的线性分离范围

对于常规大于10kDa的蛋白,一般采用以下不同浓度的SDS-PAGE分离胶配方

分离胶(配 10 mL)

胶浓度

8%

10%

12%

15%

ddH₂O(mL)

3

2.5

2

1.25

40% 丙烯酰胺母液(mL)

2

2.5

3

3.75

2x 分离胶缓冲液(mL)

5

5

5

5

10% 过硫酸铵母液(mL)

0.1

0.1

0.1

0.1

TEMED(mL)

0.01

0.01

0.01

0.01

10%过硫酸铵母液(质量体积比10%)配好后需4℃冷藏,且建议在1周内使用。40%丙烯酰胺母液和2x分离胶缓冲液配方如下:

40% 丙烯酰胺母液(32.3:1 ;配 1000 mL)

丙烯酰胺单体

388g

N',N'-甲叉双丙烯酰胺

12g

充分搅拌溶解后,用ddH₂O补足到1000mL,4℃避光保存。


2x 分离胶缓冲液(配 1000 mL)

Tris-HCl(pH 8.8)

90.8 g

SDS

2.0 g

充分溶解后,用浓盐酸将PH调到8.8,然后用ddH₂O补足到1000mL。

浓缩胶一般采用4%浓度的胶,以下为不同体积的SDS-PAGE浓缩胶配方

浓缩胶体积

4 mL

6 mL

8 mL

胶浓度

4%

4%

4%

ddH₂O(mL)

1.6

2.4

3.2

40% 丙烯酰胺母液(mL)

0.4

0.6

0.8

2x 浓缩胶缓冲液(mL)

2

3

4

10% 过硫酸铵母液(mL)

0.04

0.06

0.08

TEMED(mL)

0.004

0.006

0.008


2x 浓缩胶缓冲液(配 1000 mL)

Tris

30.3 g

SDS

2.0 g

充分溶解后,用浓盐酸将PH调到6.8,然后用ddH₂O补足到1000mL。

对于分子量小于10KDa的蛋白,建议使用Tris-Tricine胶(三层胶)体系。其中间隙胶可以阻挡一些大分子量的蛋白,从而使小分量的蛋白或肽段能够在分离胶内得到更好的呈现。

 

 Tris-Tricine三层胶示意图

Tris-Tricine-SDS-PAGE配方如下:

 

浓缩胶

间隙胶

分离胶

胶浓度

4 %

10 %

15 %

胶体积(mL)

2

1.5

6

37% 甘油(mL)

1.63

ddH₂O(mL)

1.51

0.595

40% 丙烯酰胺母液(mL)

0.2

0.375

2.25

3M Tris-HCl(pH 8.5)(mL)

0.5

2

1M Tris-HCl(pH 6.8)(mL)

0.25

10% SDS(mL)

0.02

0.015

0.06

10% APS(mL)

0.02

0.015

0.06

TEMED(mL)

0.002

0.0015

0.003

3.上样及电泳相关试剂

进行电泳之前的蛋白样本,我们还需要将其与上样缓冲液(loading buffer)混合,该缓冲液中SDS,使得蛋白变性并带有相同电荷;含甘油,增加样本密度便于样本沉淀在加样孔底部;含溴酚蓝,指示跑胶时样本的大概位置;DTT,还原打断蛋白中的二硫键。

4X SDS上样缓冲液配方如下:

4X SDS 上样缓冲液(配 1000 mL)

1M Tris-HCl(pH 7.0)母液

150 mL

甘油

250 mL

SDS

120 g

溴酚蓝

0.4 g

ddH₂O补足体积到800mL, 分装 -20℃保存。

使用前按照4:1的体积比现加2M DTT溶液(β-巯基乙醇

蛋白与上样缓冲液充分混匀后,95℃煮沸5分钟,室温冷却后即可进行上样。随后开始电泳。

电泳前我们需要准备好电泳缓冲液。常规SDS-PAGE采用的是Tris-Gly系统电泳缓冲液配方如下:

1x Tris-Gly电泳缓冲液(配 1000 mL)

Tris

3.03 g

甘氨酸

18.75 g

SDS

1 g

充分溶解后,用ddH₂O将体积补足到1000mL。

对于Tris-Tricine-SDS-PAGE采用的是Tris-Tricine系统电泳缓冲液,该缓冲液分为Tris-Tricine阴极电泳缓冲液Tris-Tricine阳极电泳缓冲液,具体配方如下:

1x Tris-Tricine阴极电泳缓冲液(配 1000 mL)

Tris

12.1 g

Tricine

17.9 g

SDS

1 g

充分溶解后,用超纯水将体积补足到1000mL。


1x Tris-Tricine阳极电泳缓冲液(配 1000 mL)

Tris

24.23 g

充分溶解后,用浓盐酸将PH调到8.9,然后用ddH₂O将体积补足到1000mL。

4.转膜及孵育相关试剂

电泳完成后,需要将胶上的蛋白转移到膜上面。需要用到转膜缓冲液。根据转膜方式不同,转膜缓冲液配方也有一定变化,以下是两种常用转膜缓冲液配方

湿转缓冲液(配 1000 mL)

Tris

2.9 g

甘氨酸

14.5 g

乙醇

200 mL

充分溶解后,用ddH₂O将体积补足到1000mL。

 

 


半干转缓冲液(用于Tris-Tricine胶转移)(配 1000 mL)

Tris

36.3 g

醋酸

6 mL

甲醇

200 mL

充分溶解后,用ddH₂O将体积补足到1000mL。

转膜完成之后,我们即可进行封闭和抗体孵育过程,这个过程中用量比较大的试剂是1X TBST洗涤液,其配方如下:

1X TBST洗涤液(配 1000 mL)

Tris

2.42 g

NaCl

8.76 g

KCl

0.373 g

Tween-20

2 mL

用浓盐酸将PH调到7.4,用ddH₂O将体积补足到1000mL。

转膜结束后,即可进行显色操作。目前一般采用增强化学发光(ECL),酶促底物DAB显色和荧光二抗显影三种方法进行显色,这些步骤都需要配套的商业化产品进行操作。

 

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